Histolojide Kullanılan Yöntemler

1-Preparasyon Yöntemleri

Taze hücre ve dokular: Kan ve lenf gibi sıvısal örnek hücreleri, derialtı bağ dokusu hücreler direkt olarak incelenebilir. Doku kalın veya katı bir organ halindeyse tuz çözeltisi içinde diderek veya ayırarak hücrelerin birbirinden ayrılması sağlanır. Taze preparatlarda hücreler gerçek morfolojilerini yitirmeden incelenir. Ancak kontrast azlığından dolayı vital boyama uygulanmalı ya da faz-kontrast mikroskop kullanarak incelenmelidir.Canlı ve taze materyelin çalışılması için lam ve lameller temiz olmalı. Canlı numuneler için kullanılan pipetler, cam eşyalar ve aletler kimyasal maddeler için kullanılanlar ile asla karıştırılmamalıdır. Herbir kültürden alınacak küçük organizmalar için ayrı bir pipet kullanılır. Her kimyasal madde için de ayrı pipet kullanılmalıdır. Saf kültür için çalışmaya başlanmadan önce cam eşyayı ve ortamı sterilize etmek gereklidir. Canlı ve taze materyel için bright-Field illumination- ışıklandırma dikkatli kontrol edilmeli, çünkü canlı hücrenin birçok yapısı refraktif indeks veya renkte çok az fark ile ayırt edilir. Küçük ve şeffaf organizmalar, serbest yaşayan protozoalar, küçük sölenteratlar, rotiferler, ectoproct lar, yassı kurtlar, nematod lar snnelidler, krustaseler ve omurgasızların ve aşağı omurgalıların larvaları, embriyoları ve yumurtaları bir iki damla su içinde incelenebilir. Tatlı su ve toprakta yaşayanlar tatlı suda ve deniz suyu veya tuzlu ve acı suda yaşıyanlar uygun tuzluluktaki suda incelenirler. Ancak su metaller, chlorine veya diğer zehirler ile kirlenmemiş olmamalıdır.Tatlı su organizmaları için havuz veya kültür kabından alınan su yeterlidir. Deniz suyu yalnız cam, porselen, toksik tipte olmayan bazı plastik ile temasta olmalı, metal borular birçok organizma için toksiktir.

Vital boyama ile hücrelerin sitoplazmasına renk ve kontrast kazandırılır. Vital boyama 2 şekilde uygulanır. Canlı hücreler boya solusyonunda ayrılarak (supra-vital boyama ) veya canlı organizmaya boyanın injeksiyonu ile (intra-vital) boyanabilirler. Canlı hücre kısımları gösterildiğinden bu yöntemler idealdir. Vital boyama ile sitoplazmik yapılar gösterilir. Çekirdek zarı vital boyalara dirençlidir. Çekirdek zarının boyalara geçirgenleşmesi hücre ölümünün ifadesidir.

2-Sitolojik Yöntemler

Hücre içeren sıvılar, aspire kemik iliği gibi ince doku parçaları lam üzerine alınır ve hücrelerin görünüşlerini koruyabilmeleri için tespit edilir. Organlar ve dokular da lama sürülerek ve smearler hücre yapısını göstermek için boyanırlar. Boyanmış smearlerin incelenmesi eksfolyatif sitolojide standart bir yöntemdir. Atipik hücrelerin bulunuşu malignite hakkında fikir verir. Diagnostik sitolojideki gelişmeler Beale (1860) ‘nin karsinoma hücreleri için vücut sıvılarını incelemesi ile başlamış ve Papanicolaou (1943) yöntemi ile ilerlemeler kaydetmiştir.

Dalak ve kemik iliği gibi organlarının kesi yüzeyine veya organın bir parçasına lam değdirilerek uygulanan impression yöntemi ile dokunun küçük bir artitektürel düzeni hakkında fikir edinilebilir. Yumuşak tümörlerde malignite bu teknikle hızla çalışılabilir.

Smearlerde hücreler yassıldıkları, dokulardan hazırlanan kesitlerdeki hücrelerden daha geniş olduklarından ve dokunun artitektürünü koruduklarından hücresel ayrıntılar daha kolaylıkla izlenir. Kesitsel tekniklere ek olarak smearler kullanılabilir.

3-Kesitsel Yöntemler

Doku parçalarından alınan örnekler yaklaşık olarak 1 hücre kalınlığında dilimlere ayrılırlar. Hücresel yapıyı görmek için bu kesitler değişik tekniklerle boyanırlar. Kesitlerin yorumu, kesitler dikey ya da yatay konumda alınmamışsa tecrübe gerektirir.

Histolojide doğru sonuç veren birçok kesitsel yöntem vardır. Seri kesitlerin alınması ile küçük bir dokunun rekontriksüyonu yapılabilir. Tüm örneklerden numaralandırılarak kesitler alınır, boyanır ve incelenir. Doku büyük ise belirli aralıklarla alınan kesitler örneğin tüm yapısını kapsamlı olarak açıklayabilir. Bu yöntem basamaklı kesit alma (step-sectioning) olarak bilinir.

Taze veya tespit edilmiş dokulardan jilet ile mikrotomsuz kesit alınabilir. Sadece yüzey boyanacağından histolojik yapı iyi gözlenemez. Bu yöntem hala dokuları tanımanın hızlı ve kolay yoludur.

Mikrotom kullanarak uygulanan kesitsel yöntemlerin çoğunda doku uygun bir kıvama getirilir, parafin, selloidin veya sentetik resinlere gömülür ya da dondurma (freezing) yapılabilir. Frozen kesitler taze dokulardan alındığı için tespite gerek duyulmaz. Diğerleri için tespit gereklidir.

Histolojik kesitler genellikle 4-7 mm kalınlığında alınır. Yağ damlacıkları, sinir fibrilleri ve kan damarları gibi geniş yapılar için 10-25 mm daha uygundur. Sentetik rezinlere gömülen dokulardan 1 mm’luk kesitler alınabilir. Doğal olarak hücresel ayrıntı daha iyi olacaktır. Elektronmikrospobik gözlemler için ultratom ile 50-100 nm’ lik kesitler alınır. Genellikle gösterim ve eğitim için çıplak gözle incelemek üzere 300-400 mm’ luk kesitler alınabilir. Bu amaçla jelatine gömülmüş organlardan geniş bir mikrotom ile kesitler alınarak incelenir.

Dokuların çoğu yumuşaktır. Dişler, kemik gibi bazı dokular ise çok serttir. Bu nedenle kesitten önce dekalsifikasyona gereksinim vardır. Matriksin kalsifikasyonun normal olup olmadığı ise dekalsifiye edilmemiş örneklerde araştırılır. Bu amaçla dens gömme ortamları ve ağır mikrotomların kullanılması gereklidir.

Mikroskobik inceleme için dokuların renge ve kontrasta gereksinimi olduğundan kesitlerin boyanması yapılır. Preperatların uygun bir kırma indisi olmalıdır. Boyama; renkli olan veya floresansı artıran boyalarla, renkli son ürünler oluşturan kimyasal reaksiyonlarla veya metalik çöktürme ile doku bileşenleri opaklaştırılarak yapılabilmektedir. Geleneksel boyama yöntemlerine ek olarak boyama-olmayan teknikler de kullanılabilir.

Histolojide floresans immünolojik yöntemler, otoradyografi, mikroinkrinasyon ve mikroradyografik yöntemler de kullanılmaktadır.

Floresans immüno-histolojik yöntemler: Florokromla işaretlenmiş antikorların kullanımına dayanmaktadır. Çok spesifik bir yöntemdir. İmmün kompleksleri ve dokulardaki yapıları göstermek için kullanılır. Floresans mikroskopta incelenen preparatlar az miktardaki florokromu gösterme yeteneğindedir.

Otoradyografi: İşaretlenmiş bir radyoaktif element dokuya verilimini takiben dokudaki hücrelerle birleşebilir. Otoradyografi bir fotografik emülsiyondaki gümüş tuzlarını indirgeme yetenekleri ile radyoaktif izotop alanlarını gösterecektir. Fotografik emülsiyon özel plaklardan çıkarılır ve kesitlere uygulanır. Çalışanlar, radyoaktivitenin zararları konusunda uyarılmalıdır. Biyolojik kullanımdaki radyoaktif izotopların yarı-ömrü birkaç saatten yıllara kadar değişebilir.

Mikroinkrenasyon (yakıp kül etme ): Lam üzerine alınan kesitler elektrikli fırında ısı yavaş yavaş artırılarak ısıtılır. Organik maddelerin tümü uzaklaştığından geriye dokunun mineral iskeleti kalır. Yansıyan ışık ve karanlık saha mikroskobu ile inkrenasyon yapılmamış kontrol kesitle karşılaştırılarak incelenir. Histospektrografik yöntemle minerallerin kantitatif ölçümü de yapılabilir.

Mikroradyografi: X-ışınlarının absorbsiyonu ile dokunun kimyasal yapısı hakkında bilgi edinilir. X-ışınlarını absorbe eden kemik, kıkırdak, enamel ve dentin gibi hidroksi-apatit kristallerini içeren kalsifiye dokular ince taneli fotografik emülsiyon ile yakın temasa tutularak yumuşak bir X-ışını verilir. Elde edilen fotograf mineralin dağılımını gösterir ve kontakt mikroradyograf olarak adlandırılır. Klasik ışık mikroskobu ile incelenebileceği gibi projeksiyon mikrografi için geliştirilen aletlerle de incelenebilir. Kesitin alanlarında mineral miktarları da ölçülebilir. Kemik örnekleri metil metakrilata gömüldükten sonra öğütülür ve parlatılır. 20 kV X-ışını ile ışınlanır. Çok ince taneli özel fotografik emülsiyonundan geçirilir. 5-10 kV’ lik çok yumuşak X-ışınları kullanılırsa yumuşak doku kesitlerinin mikroradyografları dokuların protein içeriği ve hücrelerin kuru kütlesi hakkında bilgi elde edilebilir. Mikroradyografi, bazen radyoopak maddenin injeksiyonu sonunda kan damarlarının düzenini göstermek için kullanılır.