Protein Estraksiyonu Nasıl Yapılır?

DENEYİN KONUSU : Protein Estraksiyonu

    MATERYALLER :

        1 – Homojenitör                                        8 – Mikropipetler                                        

        2 – Santrifüj                                               9 – Tampon A

        3 – Buz ve buz kabı                                   10 – Tampon B (lizis tamponu)

        4 – Steril pipet uçları                                 11 – Bistüri, pens, toplu iğne

        5 – Deney tüpü                                          12 – Petri kabı

        6 – Mikrosanrifüj tüpleri                           13 – Piset, erlen, beher

        7 - Kurbağa

        Tampon A                                                  Tampon B  (lizis buffer)

       50 mM Tris- base (pH 7.5)                         50 mM Tris-base (pH 7.5)

       2 mM EDTA                                               0.2 mM EDTA

       0.5 mM DTT                                               0.5 mM DTT

       150 mM NaCl                                             5 mM Magnezyum asetat

                                                                          %10 Gliserol

                                                                          1 mM PMSF

    DENEYİN YAPILIŞI :

        1 – Protein eksraksiyonu için ilk basamak olan kurbağa (eterle bayıltılmış olarak geldi) bistüri yardımı ile diseksiyonu yapılır ve derisi toplu iğne yardımı ile strofora sabitlendikten sonra her grup farklı bir bölümünü aldı (2. grup olarak biz kalp aldık).     

        2 – Aldığımız kalbi Tampon A içinde iyice yıkanır ( kan kalmamasına dikkat ederek).

        3 – Elimizde bulunan 0.193 gr doku parçası üzerine 1000 μl +4˚C’de Tampon B ekledik (deneyde doku parçasının 2 katı olacak şekilde eklenen Tampon B’nin yetersiz olacağından ötürü 1000 μl ekledik).

        4 – Kalp parçaları ve Tampon B karışımını 8 000 rpm’de homojenize ettik (yalnız homojenizasyon işlemi sırasında bıçakların dönme hızı çok fazla olacağı ve bununda protein yapısını bozacağından ötürü deney tüpü içindeki karışımı buz içindeyken uyguladık).

      5 – Buz kabı içinde hazırlamış olduğumuz karışımı 10 000 rpm ve +4 ˚C de 20 dakika boyunca sanrifüj ettik. Buradaki amaç ise büyük partiküllerin santrifüj ile aşağı çöktürülüp protein ve Tampon B karışımının yukarıda kalmasını sağlamaktır(yani süpernatant kısmın).

      6 – Oluşan süpernatant kısmı temiz iki  ependorf tüpüne eşit olacak şekilde aktardık.

      7 – Aktardığımız kısmı daha sonra kullanmak için -20 ˚C’de daha sonraki deneyde kullanmak için sakladık ve böylelikle deneyi sonlandırmış olduk.

    GÖZLEM ve SONUÇLAR :

      Gözlem: Santrifüjden çıkarmış olduğumuz ependorf tüplerinin içinde bulunan pelet ve süpernatant kısımlarından süpernatantı ayırarak (Protein ve Tampon B kaışımlı) diğer deneylerde kullanılamak için – 20  ˚C’de muhafazası sağlandı ve diğer deney için kullanılacak olan asıl materyali de  böylelikle hazırlamış olduk.

      Sonuç: Daha önce yapmış olduğumuz DNA izolasyon ve miktar tayini deneylerinde olduğu gibi bu deneyde de yine ikişer adet örnek hazırlayarak deneyde yapmış olabileceğimiz hataları azaltmaya çalıştığımızı çıkarmak mümkün hale geliyor. Ve ayrıca yüksek sıcaklıklar altında protein yapısındaki materyallerin bozulacağı için yapılan deneylerde soğutma çalışmalarının ne kadar önemli olduğunu da saptamak olası duruma geldi.