Clostridium spp.

Clostridium spp.

 

Clostridium spp. ilk kez 1880’li yıllarda görülmüştür. Clostridium spp her yerde bulunabilen bir mikroorganizma olup toprakta, deniz ürünlerinde, hayvansal ve bitkisel ürünlerde bulunabilir.İnsanlarda intestinal bölgede,  insanlarda ve hayvanlarda yaralı bölgelerde bulunmaktadır.

Clostridium spp. Gram pozitif, peritrik flagella ile çoğu hareketli,  obligat anaerob, katalaz negatif, fermentatif,  oval   hücre çapından daha büyük çapta , endospor üreten,  çubuk seklinde bakterilerdir. Bu bakterinin sakkarolitik ve proteolitik türleri mevcuttur.  Bu tür içinde mezofil ve termofil türlere rastlanılmaktadır. Termofilik C. thermosaccharolyticum konserve gıdalarda termofilik anaerobik bozulmaya neden olmaktadır.  Proteolitik C. sporogenes ve C. putrefaciens gıdalarda anaerobik kosullarda putrefaktif bozulmaya neden olmaktadır. Bu türler aynı zamanda CO₂ ve H₂ gazı üreterek bombaja neden olurlar. Fermantatif C. butyricum ve C. pasteurianum bütirik asit fermantasyonu sonucu bütirik asit, CO₂ ve H₂ üreterek kutularda bombaja sebep olduğu bilinmektedir. C. tetani, kirli ve derin yaralardaki nekrotik dokularda gelişerek merkezi sinir sistemini etkileyen bir toksin üretmekte ve tetanoz hastalığına neden olmaktadır. Tetanoz toksini bilinen en güçlü toksinlerden biridir. 0,25 mg toksin bir insanı öldürmek için yeterlidir.

Mezofilik C. perfringens özellikle et ürünlerinde ve C. botulinum ise düşük asitli konserve gıdalarda gelişerek gıda zehirlenmelerine yol açmakta,  C. perfringens ise kirli yaralarda geliserek gazlı kangren oluşturmaktadır. Cl. perfringens ve Cl. botulinum bu türdeki iki önemli  etkendir.

 

Clostridium perfringens

Clostridium perfringens’in sebep olduğu gıda zehirlenmesi ilk kez 1895 yılında KLEIN tarafından belirtilmistir.

C. perfringens, Gram pozitif, anaerobik,  katalaz negatif, hareketsiz, sporlu çubuk şeklinde bir bakteridir.  Sporları genellikle subterminal bazen terminal pozisyondadır. Mikroskop altında genellikle tek ve ikili görünürler. Kapsül oluştururlar. Bakteri anaerob olmakla birlikte aerotoleranttır. Beslenme istekleri fazladır. Glikozca zengin besiyerinde kısa, koka benzer, hücreler gözlenirken, nisastalı sporulasyon besiyerinde uzun hücreler olusturmaktadır. Vejetatif hücrelerin spor halinde dönüşmesi sıklıkla görülmemekle birlikte sporları genis, oval seklindedir.13-14 aminoasidi ve 5-6 vitamine gereksinmeleri, zehirlenmede genellikle proteinli gıdaların aracı olmasına gerekçe oluşturabilir. C. perfringens çok genis bir enzim spektrumuna sahip olduğu için (hemolizin, üreaz lesitinaz, kollaganez, hiyalurinidaz, deoksirbonükleaz) gereksinim duyduğu birçok besi öğesini polimerik kaynaklardan sağlayabilir. Üremenin başlaması için anaerobik kosullara gereksinim duymaktadır. A, B, C, D, E tipi toksin oluşturmalarına göre 5 tipi ayırt edilmiştir. Bu toksinlerden özellikle A ve C tipi insanlar için büyük önem taşır. Genellikle C tipi toksinin neden olduğu gıda zehirlenmeleri de A tipine oranla daha fazla önemsenmektedir. Çünkü toksin A kuvvetli karın ağrısı ve şiddetli bir diyare ile kendini belli ederken, toksin C nekrotik bir enterite neden olmaktadır. Optimum olarak 43 - 47  oC lerde gelişen bakteri minimum 12  oC ve maksimum 50  oC de gelişebilir.Sporları düşük sıcaklılara karsı dirençidir. Bu nedenle  soğutulmus ve dondurulmus pismis gıdalarda yasayabilmektedirler. pH 5.0' in altında ve pH 9.0' un üzerinde gelişemeyen C. perfringens 6.0-7.5 oC lerde mükemmel gelişir. Gelişme için gerekli su aktivite değeri yüksektir. As= 0.99' un altında gelişme hızı azalır, minimum su aktivite değeri ise As= 0.95-97 olarak belirlenmiştir. Vejetatif hücreler ısıya ve donmaya karşı duyarlıdır. Vejetatif hücrelerin ısı direnci; D60 oC= birkaç dakika (ette), sporların direnci ise; D 110 oC= 0.5 dakika olarak saptanmıştır. Nitritin besiyeri ile birlikte steril edilmesi bu maddenin inhibitif etkisini yükseltir, yani daha az sodyum nitrit ile organizmanın inhibe edilmesi sağlanır ki bu etkiye “perigo etki” denmektdir. Cl perfringens düşük su aktivitesi ve düşük pH değerlerine karsı toleranslı değildir. C perfringens sporları ısıya dirençli olup ısısal işlemler sonucu canlı kalan sporlar uygun sartlarda çimlenerek vejetatif hücreleri olustururlar. Enterotoksin sentezini sporulasyon asamasında gerçekleştirmesi de sporulasyonun önemini artırmaktadır. Gıda zehirlenmesinde gıda ile birlikte alınan vejetatif hücrelerin ince bağırsaklarda sporulasyonu sırasında sentezlenen egzotoksijenik karakterli enterotoksin hastalığa yol açmaktadır. C. perfringens sporulasyonu yeterli düzeyde olmadığından, dolayısıyla yeterli miktarda enterotoksin sentezlenemediğinden C. perfringens zehirlenmesine enfeksiyon tipi gıda zehirlenmeleri gurubunda yer verilir.Sporulasyon aralığı daha dar olup 35-40^oC, pH 6-8, su aktivitesi ise 0,98 dir.

C perfringens sporları sıcağa dayanıklı olanlar ve sıcağa hassas olanlar seklinde farklı gruplara ayrılmaktadır. Isıya dayanıklı sporlar 100oC de 5 saat yasabilmektedir.

 

Bulunduğu Yerler

Doğada çok yaygın olarak bulunur. Toprak, hava, su, kanalizasyon suları, insan ve hayvanların dışkıları ve barsak sistemlerinde bulunur. Bu nedenle yayılmaları ve gıdaları kontamine etmeleri de kaçınılmazdır.

En çok görülen gıdalar;

•      et ürünleri

–      kızarmış biftek,

–      ızgara köfte,

–      ızgara biftek

•      tavuk eti,

•      balık ve ürünleri

Pişmiş gıdalarda da ısıya dirençli sporlardan bir kısmı kalabilir ve sonradan hızlı bir soğuma sağlanmaması durumunda, sporların çimlenerek (jerminasyon) tekrar vejetatif hale geçmesi için oksijenin ortamdan kısmen uzaklaşması da uygun koşul sağlar.

C. perfringens zehirlenmeleri, genellikle

–      okul kantinleri,

–      hastaneler,

–      hapishaneler gibi toplu yemek tüketim yerlerinde sıklıkla görülmektedir.

Bu bakteri genellikle mide pH’sında öldüğünden dolayı genellikle gıdadaki bakteri sayısı 10⁵-10⁶kob/g olduğunda zehirlenmeler görülür.

Hastalık Belirtileri

En önemli belirti karın krampları ve diyaredir.

Ender olarak ateş, kusma, kanlı dışkı görülebilir.

Hastalık gıda üzerinde belli bir sayıya ulaşmış (106/g) C. perfringens hücrelerinin gıda ile vücuda alınması sonucunda ortaya çıkar.

Bu hücreler barsak sistemine ulaştıklarında gelişme ve sporulasyon için uygun bir ortam bulurlar. C. perfringens hücreleri sporulasyon evresinde enterotoksin oluştururlar. Sporulasyonun son aşamasında hücre lizizi ile barsak sistemine geçen toksin kapiler geçirgenliği arttırarak aşırı sıvı hareketlerine neden olur. Enterotoksin sitotoksik etkiye de sahiptir, o nedenle barsak epitel hücrelerinde membranı harap eder. Nekrotik enteritlerin ortaya çıkmasına neden olur. C. perfringens' in A tipi tarafından oluşturulan toksinin 36 000 Da ağırlığında bir protein olduğu ve ısıya dirençsiz olan toksinin 60 oC de inaktive olduğu saptanmıştır. Üzerinde spor oluşmuş (enterotoksin oluşmuş) gıdalarla zehirlenmenin meydana gelmesi hemen hemen olanaksızdır. Sporulasyon ve liziz evresinin gıda üzerinde tamamlandığını düşünülse bile gıda tüketilemeyecek derecede bozulacağından intoksikasyon şeklindeki gıda zehirlenmesinin bu bakteri ile gerçekleşmesi olanaklı değildir. İnkübasyon periyodu genellikle 8-24 saattir. Yaşlı ve genç hastalarda dehidrasyonla birlikte ölüm görülebilmektedir.

Analiz

Clostridium perfringens' in sayımı için saklanan gıda maddesinin dondurulmamış olması gerekir.  Analize alınacak örneğin 1:1 (g/v) oranı ile % 10' luk gliserinle karıştırılarak analiz yapılana kadar 5 ^oC nin altında saklanmalıdır. Zorunlu nedenler ile 8 saat içinde analiz yapılamıyor ise örneğin tamponlanmış steril gliserin-tuz çözeltisi içinde -60^oC de dondurulmasıdır. Kısa süre bekleyecek örnekler 10 ^oC de tutulurlar. Çünkü C. perfringens' in vejetatif hücreleri donma sıcaklıklarına çok duyarlıdır. Bu uygulama yapılmazsa soğukta bekletme veya dondurarak saklama süresinde bakteri canlılığını yitirmiş olacağından yanlış sayım sonuçları alınabilir.

Sayım için Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) Agar kullanılır. Bu besiyeri içinde bulunan sülfit Clostridium 'ların büyük çoğunluğu gibi C. perfringens tarafından da sülfide indirgenir. Besiyerindeki demir (3), amonyum sitrat demir sülfid oluşturarak koloninin siyah renk almasına neden olur.

Örnek sıvısı ve ardışık dilüsyonlarından dökme yöntemi tekniği ile ekim yapılır.  Plaklar 37 oC de 20 saat anaerob inkübasyona bırakılır. Anaerobik inkübatör yoksa çift katlı ekim uygulanması düşünülmelidir. TSC Agar üzerindeki siyah koloniler sayılarak gıdadaki hücre sayısı hesaplanır.

TSC Agar üzerinde gelişen tüm kolonilerin C. perfringens olduğu düşünülemez. Diğer sülfit indirgeyenler de (C. bifermentans, C. sphenoides, C. fallax) aynı renkte koloni vereceklerinden, siyah kolonilerin mutlaka uluslararası yönetmeliklerde bulunan testlerle tanımlanması gerekir.

ISO, FDA, 35 LMBG gibi standartlarda; suşların hareketsiz, nitrat pozitif, laktoz pozitif olduğunun, jelatini sıvılaştırdığının, Reverse-CAMP testinde pozitif sonuç verdiğinin gösterilmesi öngörülmüştür. Bununla birlikte bu testlerden nitrat indirgeme ve jelatini sıvılaştırma testlerinde doğru sonuçların alınması her zaman mümkün olmayabilir.

İdentifikasyon testlerinden en fazla hareket, laktoz fermentasyonu, Reverse-CAMP ve asitfosfataz testlerine güvenilmektedir. Bunlar aynı zamanda doğrulama testleridir.  Reverse-CAMP testinde % 5 defibrine koyun kanı katılarak hazırlanan Columbia Agar (Oxoid) plağının ortasına, plağı iki eşit parçaya ayıracak şekilde iyi üremiş Streptococcus agalactiae kültüründen bir öze alınarak çizilir. Bu çizgiden 1 mm aralık bırakılarak ve çizgiye dik olarak test edilecek C. perfringens kültürlerinden sağa doğru ayrı ayrı paralel çizimler yapılır. 37 oC de 24 saat inkübasyonun ardından sağa doğru çizilen suşlarda lobut veya pipo formlu geniş ß-hemoliz zonları gösterenler pozitif olarak değerlendirilir.

C. perfringens 'in doğrulanması, laktoz ve sülfit testlerini kombine hale getirmiş olan Lactose Sulfide (LS) Medium besiyerinde yapılır. Gaz oluşumu ve siyah presipitat sonucun pozitif olduğunu gösterir.

Asitfosfatazın belirlenmesi, Columbia Kanlı Agar plaklarında geliştirilen şüpheli C. perfringens kolonileri üzerine fosfataz reaktifi döküldüğünde gelişen kahverengi-viyole rengin pozitif olarak değerlendirilmesiyle yapılır. C. perfringens 'in asitfosfataz özelliğinden yararlanılarak geliştirilen bir besiyeri de Tryptose Sulfite Cycloserin (TSC) Agar'a MUP (4-methylumbelliferyl phosphate) katılarak hazırlanan C. perfringens' in sayılması amacıyla son yıllarda geliştirilmiş bir besiyeridir. TSC-MUP Agar üzerinde gelişen bakterinin oluşturduğu asitfosfataz florejenik bir madde olan MUP' ı ultraviyole ışını altında 366 nm de floresan veren 4-methylumbelliferona dönüştürmekte, böylece koloniler belirgin olarak tanınmaktadır. C. perfringens toksinleri, Ters Pasif Lateks Aglutinasyon (RPLA) tekniği ile hazırlanmış PET-RPLA (Unipath) test kiti kullanılarak da belirlenebilmektedir.

Clostridium botulinum

Clostridium botulinum ilk kez 1895 yılında E. VanERMANGEN tarafından tuzlu jambonlardan izole edilmistir. Yunanca da salam-sosis anlamına gelen botulustan esinlenerek Bacillus botulinus olarak isimlendirilmiştir Bacillaceae familyasında bulunan Clostridium cinsinin bir üyesi olan C. botulinum 'un nörotoksini bilinen en öldürücü doğal bileşiklere örnek oluşturmaktadır.

C. botulinum, obligat anaerobik, Gram pozitif, çubuk şeklinde, sporlu bir bakteri olup sporları oval veya silindiriktir. Boyutları 2-10 μm civarındadır. Peritrik falegelları ile hareketlidir. Besiyerlerinde zincir      yapabilir. Terminal veya supterminal olan sporlar oval ve bakteriden geniş olduklarından çomakçığın şeklini bozar

Anaerop bir bakteri olup,bu koşullar sağlandıktan sonra adi besiyerlerinde üreyebilir. Optimal üreme ısısı 30^oC olmakla beraber oda derecelerinde (20^oC)üreyebildiği  görülmüştür. C. botulinum optimum olarak pH 6.0-7.5 arasında gelişir. pH 4.5' un altında gelişmeleri engellenir. C. botulinum en iyi nötr pH da gelişir. pH 4,7 nin altında ve 8,9 üstünde toksin üretmemektedir. Sporlarının çimlenmesi için minimum sıcaklık ve pH istekleri bakterinin gelişebilmesi için gerekli minimum değerlerden biraz daha yüksektir. Sporların çimlenebilmesi için en düşük derece 15 ^oC ve en düşük pH 5.0-5.1 olarak belirlenmiştir. Genel olarak pH' nın spor çimlenmesi ve gelişme için optimum oluşu toksin oluşumunu da stimule eder.  Toksin oluşumunda minimum su aktivitesi değeri;  A ve B için As= 0.94,  E tipi için de As= 0.97' dir.  Sıcaklığa dirençleri; A ve B tipleri için D121 ^oC = 0.2 dakika, F tipi için D121 ^oC = 0.17 dakika olarak belirlenmiştir.  % 10 oranında tuz ve % 60 oranında sakkaroz ortamlarında C. botulinum toksin oluşturmaz.  Tuzun daha düşük konsantrasyonları (% 3.0-3.5), eğer beraberinde koruyucu teknolojik bir işlem (tütsüleme, ısıl işlem uygulaması) varsa toksin oluşumunu engeller.  Gıdalara katılan nitratlar da gelişmeyi ve toksin oluşumunu, O/R potansiyelini yükselterek ve hidroksilamin (NH₂OH) oluşturarak engeller. Glikozlu besiyerlerinde  daha bol ürer. Jelozdaki  yüzeysel kolonileri büyük,kaygan,orta kısımları mat,kenarları hafif saydam ve flamanlı R tipindedir.  Kanlı jelozda hemoliz yaparlar.  Jeloz içerisinde hafif bulanık mercek veya kalp şeklinde koloniler oluştururlar. Laktoz,kitoz,salisin dışında birçok şekerlere etki ederek asit ve gaz yaparlar. H2S yapar,sütü önce pıhtılaştırır sonra  yavaşca eritirler. Vejetatif şekilleri dayanıksızdır. Sporları, kuruluğa uzun yıllar, nemli ısıda 100oC’ye 6 saat, 120oC’ye 10 dakika, 180oC’ye 5-15 dakika dayanırlar.  Antiseptiklere karşı direnç gösterirler. DNA’daki G+C oranı %26-28 mol’dur.  Bu bakteri olusturduğu farklı antijenik yapıdaki nörotoksin tiplerine göre sınıflandırılmaktadır.

Bu nörotoksinler A, B, C (Cα, Cβ), D, E, F, ve G dir . İki farklı toksini bir arada üreten türler de vardır.  İnsanlarda en sık botulizme neden olan A ve B tipi toksinler olup bunlar toprakta yaygın olarak bulunmaktadır. C ve D tipleri hayvanlarda botulizm etmeni olarak belirlenmiştir

Bulunduğu Yerler

Clostridium botulinum suşlarının doğal habitatları toprak ve deniz tabanları ile kıyı sularıdır.  Göllerin sedimentlerinde, balıkların sindirim kanallarında, bahçede yetiştirilen sebzelerde bulunurlar.  Bunlardan özellikle E tipi kıyı sularında ve balıklarda görülür. Topraktan her tarafa dağılımı söz konusudur.

Patojen Olarak Önemi

C.botulinum, genel olarak organizmaya yerleşme ve yayılma yeteneği yoktur.  Botilusmus, C.botulinum toksininin yaptığı bir hastalıktır. Toksinler sıcaklığa dayanıksız, suda çözünebilen, asitlere dirençli yüksek moleküllü proteinlerdir. Toprakta ve hayvan bağırsak içeriğinde yaygın olarak bulunan sporlar, hayvanların kesim işleminde etlere ve topraktan sebzelere geçerler. Bunlardan hazırlanan çeşitli ve daha çok konserve şeklindeki besinlerde anaerob koşulları bulan sporlar, vejatatif hale gelirler. oda ısısında bile ürerler ve bulundukları yerde toksin yaparlar. Hastalık bu toksinli besin maddelerinin, iyi pişirilmeden yenmesi ile oluşur. C. botulinum başta toprakta ve suda bulunmakla birlikte, bu yönde en çok sorumlu yiyecekler  pişirilmeden yenen baharatlı,  tütsülenmiş, vakumlu, alkali et ve sebze konserveleridir.

düşük asitli ev konserveleri,

konserve et ve et ürünleri,

sebze konserveleri ve sebzeler,

balık ve balık ürünleri,

Pek çok gıda zehirlenmesi olayının ise ev yapımı gıdalar ve sebzelerden kaynaklandığı belirtilmektedir.

C. botulinum toksinleri bilinen en kuvvetli biyolojik toksinler olup 1 gramı 140 milyon insanı öldürecek güçtedir. Bu toksinlerin inaktivasyonu için 79^oC de 20 dakika veya 85^oC de 5 dakikalık ısıl islem gerekmektedir. Gıda intoksikasyonunda inkübasyon süresi genelde 13-36 saat olup 2 saat ile 8 gün arasında inkübasyon süresi belirtilmiştir.

Hastalık Belirtileri

Hastalığın baslangıcında bulantı, kusma ve ishal gibi gastronintestinal belirtiler ve halsizlik bas dönmesi, bas ağrısı görülür.Botulizm halsizlik ve kaslarda güçsüzlükle  başlar. Bu belirtileri göz kapaklarında düşme, bulanık ve çift görme, ağızda kuruluk, konusma yutkunmada zorlanma gibi sikayetler takip eder. İstemsiz kaslarda giderek artan felç olusur ve 3-5 gün içinde genellikle solunum yetmezliğinden ölüm görülür. Botulizm Clostridium botulinum nörotoksininin neden olduğu bir intoksikasyon olup beş farklı şekilde gelişir. Bunlar,

Gıda botulizmi (gıda intoksikasyonu): Bulaşmış yiyeceklerin mideye indikten sonra botulinum’un aktif hale geçmesi ile ortaya çıkar.

Yara botulizmi: Yara kaynaklı da ortaya çıkabilir. Ancak çok nadirdir. Toksini vücut içinde aktif hale geçer, yara üzerinde gelişerek, vücutta enfeksiyon meydana getirir.

Bebek botulizmi: Botulizm başlangıcında, botulinal toksin vücut içinde olgunlaşır ve gelişir. Sonra bağırsak sistemine geçerek koloniler teşkil ederler.

Gizli botulizm (hidden botulism) :Botulizm başlangıcında, botulinal toksin vücut içinde olgunlaşır ve gelişir. Sonra bağırsak sistemine geçerek koloniler teşkil ederler.:

İnadvertent botulizm : C.botulinum’lar determine olmadıklarından besin içerisinde uygun koşullarda 12 ay yaşayabilirler. Bunlar yara kaynaklı olanlardır.

Botulizm nerotoksinleri sadece aminoasitlerden olusan basit protein yapıdadırlar.

Staphylococcus toksinlerinin aksine botulinum toksinleri ısıya hassas olup 10 dk kaynatmayla yıkımlanabilmektedir.

Botulizm diğer gıda kaynaklı hastalıklara oranla daha seyrek görülmekle birlikte,ölüm oranının yüksek olması nedeniyle önemlidir  Toksin, organizmanın logaritmik geliş evresinde sentezlenmekte ve hücre içinde birikmekte, logaritmik gelişme döneminin sonunda büyük olasılıkla liziz sonucu ortama geçmektedir. Gıda ile alınan toksin ince barsağa ulaştıktan sonra burada absorbe olur ve lenf sistemi yolu ile kana karışır. Ardından sinir sistemine ulaşan toksin burada belirli noktalara bağlanarak sinirlerin komuta ettiği kaslara komutların gönderilmesini engellemekte ve kasların paraliz (felç) olmasına neden olmaktadır.

Nörotoksik etkili proteinin, sinir düğüm ve kavşaklarında uyarı mesajlarının iletilmesini bloke ettiği, bunun sonucu olarak da sinir uçlarında asetilkolinin serbest hale geçmesinin engellendiği bilinmektedir. Anlaşılamayan kısım ise bu sonuca götüren blokajın nasıl olduğudur. Kesin olan, toksinin etkisinin nöromuskular blokaj şeklinde ortaya çıktığıdır.

Kontrol yöntemleri

C.botulinum sporları doğada toprakta ve hayvan bağırsaklarında çok yaygındır. Sebze ve et gibi besin maddeleri bu yol ile kirlenirler. C.botulinum’un gelişerek yüksek nem , düşük asit(pH 4.6’dan büyük), O2 ‘siz ortam ve soğutucu dışında bekletilmesi durumlarında toksin üretmesi daha kolaydır. Besin endüstrisinde fiziksel yollar ve kimyasal ilaçlar kullanılarak, C.botulinum sporlarının gelişimi ve ardından göstereceği toksik etki önlenebilir.  Bu tip medotların kullanımı ile vejetatif hücre ve sporların besinlere bulaşması önlenir. Ayrıca pastorizasyon ile de kontrol sağlanabilir. Konservelerde kalan sporlar harap olmadıkları zaman vejatatif forma geçen bakteriler çoğalarak toksin yaparlar. Sporların ölmesi için konservelerin 120 ^oC’de 30 dakika tutulması gereklidir. Bu düşük asitli konserve gıdalarda ısı yanında kontrol işleminde nitrit ve tuz da kullanılır. Et konserveleri, sucuk, sosis,fasulye ve bezelye başta olmak üzere çeşitli sebze ve bir kısım balık konserveleri botulismus yönünden sorumlu olabilirler. Bu yöntemlere ilaveten değişik vakum altında paketlenen etlerin buzdolabında saklanması sayılabilir. Nem yüzdesinin 0,93’ün altında olması besinlerin besinlerin saklanmasında emin bir yöntemdir. Dondurularak bekletmek bakterinin gelişmesini ve toksik etki göstermesini önleyen önemli bir yöntemdir. Salamura edilmiş besinler botulizm açısından daha güvenilirdirler. Çünkü bunların yapımında nitrit bileşikleri kullanılmıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalar, sodyum nitritin C.botulinum’un gelişmesini ve toksin oluşturmasını önlediğini açıklar. Özellikle bu salamura yapılmış etlerde kullanılır. Salamura etlerde nitrit tek başına kullanıldığında önleyici etki göstermez. Diğer materyallerle etkileşime geçerek C.botulinum sporlarının üremesi ve toksik etki göstermesi için uygun ortamı hazırlar. Nitritli ortamdaki sıcaklık, asidite, tuzluluk ve bakteriyal spor seviyesi C.botulinum’un gelişimi ve toksidite göstermesi için uygundur. Botulizme neden olan en büyük kaynaklar arasında evde yapılan besinler ve konserveler de vardır. Bu yüzden besin endüstrisinde C.botulinum’un toksidite göstermesini önleyici şekillerde besinler işlenmektedir. Tüketiciler özelikle bilinen kontrol medotlarını tercih etmelidir. Alışverişte soğutulmuş ve dondurularak depolanmış besinler esas kriterleri oluşturmalıdır.

Clostridium botulinum ve Toksinlerinin Belirlenmesi

Clostridium botulinum' un gıda içerisinde kültürel yöntemle varlığının gösterilmesi veya sayılması intoksikasyonun seyri dikkate alındığında çok fazla anlam taşımamaktadır. Gıdalarda toksinin belirlenmesinde kullanılan geleneksel analiz yöntemi farelerle yürütülen letal doz testidir. Bu yöntem günümüzde hala en geçerli yöntem olarak kullanılır. Farelere farklı antitoksinler verilerek gıdadaki enterotoksin tipi nötralizasyon sonuçları ile ortaya konulabilir.

 C. botulinum nörotoksinlerinin belirlenmesi için birçok immunolojik yöntem geliştirilmiştir. Ancak geliştirilen immunolojik analiz yöntemlerinde belirlenen immunolojik aktivitedir.  Toksinin biyolojik aktivitesini ortaya koyabilecek yöntemlerin de geliştirilmesi gerekmektedir. Bugün için Sandwich ELISA, floresan antikor teknikleri veya RPLA testleri henüz fare denemelerinin yerine geçebilmiş değildir. Örneğin RPLA testinin, toksini değil, toksin komponentlerinden birini belirlemeye yönelik olduğu belirtilmiştir. Floresan antikor tekniği bakterinin E tipi toksini için kullanılmaktadır. Ancak gıdalarda henüz bu yolla toksin saptamak mümkün olamamaktadır. Monoklonal antikor tekniğinin gelişmesi ile gelecekte immunolojik toksin belirleme yöntemlerinin hayvan denemelerinin yerine geçeceği düşünülmektedir. PCR ve gen sondalarının da henüz başarılı kullanımları görülmemektedir.  Clostridium botulinum' un spor varlığının ballarda gösterilmesi tüm gıdalar içerisinde üstünde en fazla durulan konudur. Süt emmekte olan bebeklerde spontan olarak ortaya çıkan bebek botulizmlerine C. botulinum sporları neden olur. Sporların jerminasyonu ile barsakta gelişen C. botulinum vejetatif hücreleri, toksin oluşturarak bebek botulizmlerini yaratır. Bu şekildeki vakaların ABD, Japonya ve İngiltere' de ortaya çıktığı belirtilmektedir. Ballar da A ve B tipi

 toksin yapan C. botulinum sporlarını içerdiklerinde aynı tehlikeli sonucu yaratabilmektedir. İşte böyle gıdalarda C. botulinum varlığının veya sayısının belirlenmesi yerine gıda içerisinde veya örneğin broth kültüründe toksinin geliştirilmesi ve gıda ekstraklarının deney farelerine verilerek, toksin oluşumunun ispatlanması yoluna gidilmektedir. Bu yolla balda C. botulinum veya spor varlığı belirlenmektedir.

C. botulinum' un izolasyonu ve identifikasyonu amaçlandığında ise bakteri tehlikeli olduğundan toksoidlerle korunmak gerekir. C. botulinum içerdiği düşünülen gıdanın 1:1 oranıyla absolü alkol içerisinde oda sıcaklığında bir saat tutulması, refakatçi floranın ve C. botulinum vejetatif suşlarının öldürülmesi için gereklidir. Bu karışımdan öze ile Egg Yolk Agar (EYA) veya Liver Veal Egg Yolk Agar (LVEYA) plaklarına sürülür, plaklar 35 oC de 48 saat inkübasyona bırakılır. Bu besiyerleri üzerinde C. botulinum beyaz-sarı, yassı, homojen olmayan tipik koloniler oluşturur. Kolonilerin etrafında sedefli parlaklık gösteren presipitasyon zonları eğik ışıkta bakıldıklarında daha belirgin olarak görülürler. Diğer Clostridium türleri de aynı tarzda koloni verebileceklerinden, en az 3-5 koloni CMM' a (A, B tipi için) ve TPGY Broth' a (E tipi için) aşılanır. Birinci besiyeri 35 oC de, ikinci besiyeri 26 oC de 5' er gün inkübasyona bırakılır. Gelişen kültürlerde biyokimyasal testler yürütülür.

Zenginleştirme gerekiyorsa; işlenmemiş ve az işlenmiş gıdalar için Differential Reinforced Clostridial Broth (DRCB) veya Modified Peptone Colloid Broth (MPCB) kullanılır. Çok fazla işlem görmüş gıdaları ise taze hazırlanmış Pork Pea Infusion Broth (PPIB) veya Beef Infusion Broth (BIB) besiyerlerinde 37 oC de 72 saat zenginleştirmek gerekmektedir. Gelişmenin görüldüğü tüplerden seyreltiler yapılarak Sülfite Polymyxin Sulfadiasine Agar (SPSA) plaklarına ekim yapılır ve 32 oC de 48-72 saat inkübasyona bırakılır. Plakta gelişen siyah kolonilerden 3-5 adet seçilerek biyokimyasal testler gerçekleştirilir.